片上实验室的新进展

2004年8月A版

　　当前，半导体集成技术终于转向了90nm线宽工艺，开始进入纳米领域，预料今后将再发展65nm、45nm的细微加工技术，人类拥有的细微加工技术将真正达到纳米技术的水平。把这种纳米技术应用到生物化学领域目前极受关注。

何谓片上实验室

　　近年来，把科学的分析操作集成到像半导体集成电路那样的几个平方厘米的玻璃、硅或塑料等微型薄片上的研究正在蓬勃开展，这在美国叫做片上实验室(Lab-on-a-chip),在欧洲称为MTAS(Micro Total Analysis Systems,微型综合分析系统)。它是指利用细微加工技术在玻璃或塑料基板上制作成溶液流动的微小通道网络，在一只芯片上集成如在实验室进行生化、化学操作和检测。

　　由于其微小，必然具有样本微量化、反应与分析高速化等多种优点。其方法虽各有不同，但就其根本目的来说，进行的纳米级的化学及生物高分子等的性质和功能分析，或者对其人工合成与控制则是共通的。为此，今天已应用了纳米技术。

片上实验室与纳米技术

　　关于应用纳米技术及反应场微小的效果包括：①因扩散而易于产生混合，即反应场体积如为1/10，则扩散时间将缩短为1/100；②提高每单位体积的表面积比，这可望热的进出及表面-液体间的相互作用(包含催化剂化学反应等)高效化。③提高通道每单位截面积的周长比；由于壁面与液体的粘着力的影响比惯性力增加更大，故通道中的液体易形成层流。

　　目前主要是利用①、②效用研究通道中液体与液体界面化学处理，但如能通过纳米表面结构加工等纳米技术进行控制，则可望利用②的效用，开发固体、液体表面反应高效化的反应堆。此外，由于nm级的空间控制可实现微小空间的精密环境控制，故有可能发展如设计生物分子之类的制作技术。

　　此外，如考虑到nm大小的蛋白质或其集合体(生物分子机械、生物纳米机)负有生命的功能，则必须测量单个分子或单分子机械的功能，直接观察、操作这一测量的技术已在开发中。

片上实验室对染色体分析的必要性

　　包含人的遗传基因信息的全部DNA信息(碱基系列)的人类染色体排序已接近完成。人类染色体计划由于DNA排序技术的显著进展，将比预定期限更短成功实现(图1)。人类已处于后染色体时代的起点。

　　即使在后染色体时代，染色体及DNA分析仍然重要。分析每个人染色体信息差异的SNP分析，分析比较人以外生命的染色体信息来深刻理解生命现象的比较染色体学等，都必须由庞大的样本和信息进行归纳或演绎分析，因此，更高速的DNA排序技术将是不可缺少的。近年来大受重视的按染色体制药实现的定制式医疗，就需要各个人的染色体分析。

　　人染色体有约32亿个碱基，1000人的染色体信息就会有3T个(T=1012)碱基，地球规模计人染色体信息将是18E(E=1018)的天文数字。要获得这样庞大的信息现有技术将受到限制，只有前所未有的崭新技术才有望在后染色体排序时代发挥极为重要的作用。

　　作为把握下一代技术开发关键的基础技术，基于半导体技术的微纳米技术与提取生命信息的湿化学技术的结合、阵列排布和集成最为重要，片上实验室在目的及技术方面将是所追求的，也必将应用于染色体分析。在这一背景下，便出现了应用细微加工技术的DNA芯片及电泳芯片等独特的微芯片DNA分析技术。

DNA芯片与微阵列

　　DNA芯片是把序列各异的许多(几千至数万种)DNA片断排列固定在玻璃或硅基片上，以预先用萤光试剂标准化的DNA样本擦该芯片，利用作成DNA互补的双层螺旋状的性质，用激光束检测样本DNA与DNA芯片上的某种DNA是否产生相互作用(杂混)。

　　DNA在芯片上的固定大致分为化学结合型和定位型两类。通常，把化学结合型叫做DNA芯片，而把定位型叫做微阵列。

　　DNA芯片及微阵列最重要的应用领域是遗传基因的显现分析。在人染色全中，遗传基因总共有3~4万种，其中实际起作用(显现)的遗传基因只有一部分，而且不同的细胞其显现遗传基因不一样。比如，比较癌细胞与正常细胞，若研究癌细胞中经常显现的遗传基因或不显现的遗传基因，其中就应该有把握致癌机理关键并成为治疗对象的遗传基因。若知道遗传基因，便可望大规模进行疾患的诊断和治疗了。

　　遗传基因显现分析情况下，要知道遗传基因的显现，必须知道显现生成的RNA(传递核糖核酸)。首先从细胞中取出mRNA，利用逆复写反应配制加入了萤光标识的目标cDNA(互补DNA)。将该cDNA杂混在微阵列中，使可用萤光成像分析器检测出来。例如，根据人癌细胞与正常细胞的微阵列分析结果，可以发现两种细胞间遗传基因显现量的不同，通过对它们的数据库检索，便能发现癌细胞中经常显现的遗传基因。

微芯片电泳

　　DNA的排序方法一般采用圣伽法。圣伽法中DNA片断的分离最初通过平板型聚丙烯酰胺凝胶电泳实现。它是在两块玻璃板间用凝胶作隔离物。但是在人染色体计划中，取代该分离法利用毛细管电泳进行处理，实现了处理速度的飞跃提高。

　　现在还开发了在微芯片上的通道中实现染色体排序的技术，证明20分钟即能实现每个通道中解读600碱基的遗传信息。此种微芯片排序器能达到现有DNA分析设备1000倍以上的高速度，是一种极具魅力的新技术。

　　图2示出微芯片电泳的概念。首先，在所有流路及各贮液槽(图2中a凝胶贮液槽)中注入泳动缓冲液。其后在样本贮液槽中加入样本，如图2(b)加上电压，在几十秒内样本DNA将均匀充满样本引入流路。然后如切换所加电压(图2(c))，存在于流路接头部的一定量的样本将移动到分离流路，利用电泳进行分离、检测。此时，由于留在样本引入流路内的剩余样本远离流路接头部，对外部的贮液槽仍加正电压，如图2(d)。

　　图2右边是使用了3种DNA混合溶液对该样本引入情况的成像。在样本引入1秒钟后DNA呈极尖锐的的带状进入分离通道，到6秒钟后便看到3种DNA带状物开始分离，由于这种样本引入法的采用，与毛细管电泳不一样，能达到定量的样本引入。

DNA单分子分析的挑战

　　利用微芯片电泳之各种方法虽能进行DNA排序的高速化，但如考虑将来染色体医疗等后染色体研究(参见图1)，必须有提取庞大达E级的碱基序列信息的排序技术。为实现DNA排序的全新高速化，正在挑战DNA单分子分析，目前虽在研究阶段，但研究甚为活跃。试举意味深品的一例。

　　据哈佛大学的Branton等称，已试验过DNA单分子通过纳米的排序，由D-溶血素葡萄球菌的蛋白质毒素)自身作用形成直径1.4nm的纳米孔，在具有此种纳米孔通道的脂质双层膜两边加电压，此时电解质在溶液中溶解，由于通过纳米孔的离子传导，便有微微安级电流流过。当带负电的DNA分子被拉向阳极时，堵塞了作为离子通道的纳米孔，离子传导受到限制，从而检测出电流值的改变。

　　根据通过的碱基种类A、T、C、G产生的电流值变化，便可实现排序。由于DNA分子的毫秒级通过纳米孔，基实现就可能达到高速排序。迄今已在聚腺嘌呤与聚胞嘧啶之间发现了电流值变化的差异。但为了排序，还需要灵敏度更高的检测器等，尚有许多必须改进之处。

走向高度集成系统

　　所介绍的电泳芯片已开始有设备出售了，微芯片技术为了更大提高处理能力，正在发展成为把从细胞的DNA提取、PCR(聚合酶连锁反应)等反应、电泳、杂混、激光诱发萤光检测、电化学检测、热透镜显微镜检测等染色体分析所必需的所有基本处理，集成到几平方厘米的微芯片上的集成型微芯片。

　　而且，随着集成化技术的急速进步，细微加工将从微米领域转向纳米领域。代替过去用作DNA分离媒体的凝胶和聚合物，而把采用纳米细微加工技术作成的纳米柱配置在微通道中，实现不同凝胶或聚合物的DNA及蛋白质的分离，开发出微芯片上具有各种纳米结构的器件，并实现极微量或单分子DNA或蛋白质提取、放大、排序、多项检测等集成化超高速分析技术。这样的纳米芯片技术也在进行研究。

　　DNA分析中各种处理迄今都进行了高速化的研究，但通过如图6所示把所有处理微化、集成在同一芯片上，由于能激剧缩短各处理花费的时间，便可望使整个过程大大高速化，这才将真正进化到“片上实验室”。(蔡)