非成像式流式细胞仪的发展与应用

　　流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）也称为荧光激活细胞分类术（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS） ，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer）是集激光技术、光电检测技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术以及计算机技术于一体的新型高科技仪器。它能够高效检测细胞大小、粒度、表面积等细胞结构参数和细胞表面 / 胞质 / 核的特异性抗原、细胞内细胞因子、酶活性、Ca2+、细胞活性等细胞功能参数， 同时还具有细胞分选和计数能力。自上世纪70年代第一台流式细胞仪问世以来，历经 40 多年的迅猛发展，目前流式细胞仪已经广泛应用于生物学、药理学、免疫学、血液学、肿瘤学以及细胞凋亡检测和临床检验等领域。

　　1  流式细胞仪的结构

　　流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统和细胞分选系统 4 部分组成。经过特定荧光染色的待测样本细胞悬液，在鞘流的包围约束下，细胞成单列排布，由流动室喷嘴高速喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束垂直相交，相交位置即为检测区，在入射激光照射下产生荧光信号和前向散射光信号（FSC，Forward Scatter）与90°侧向散射光信号（SSC，Side Scatter） ，可被电子系统检测并输入到计算机利用专业软件进行细胞多参数分析与分选。

　　1.1  液流系统

　　液流系统主要负责将待测样品从样品室运送到流动室的测量区域，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心，并且在一次曝光时间内，只允许一个细胞通过激光束，然后根据需要，液流流入废液桶或者分选收集管。液流系统主要由流动室和液流驱动系统构成。流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的包围下，细胞排成单列从流动室的喷嘴流出，并且被鞘液包围形成细胞液柱。另外，同轴流动的设计，使得样品流（核流）和鞘流始终保持分层鞘流的状态。

　　1.2  光学系统

　　光学系统负责产生并采集荧光、散射光信号，主要由包括激光、光纤、光束形成棱镜、聚焦镜的光学激发系统和包括荧光物镜、光纤、光学滤片、检测器的光学采集系统组成。目前流式细胞仪广泛使用的是 488nm 的氩离子激光器和 635nm 的氦 - 氖激光器。光学滤光片放置在光电倍增管前面，对去除干扰信号、提高结果的准确性至关重要。

　　1.3  电子系统

　　电子系统的功能是将荧光和散射光信号转换成电信号， 并进行数字化处理后送入计算机用专用软件进行分析，包括光电转化器、信号放大器、信号处理系统和计算机软件分析系统。液柱中的细胞经过测量区域被激光照射，产生荧光信号和前向角散射与 90°侧向角散射信号。其中荧光信号由光电倍增管检测，2 个散射光信号由光电二极管检测。荧光信号与产生荧光的化学物质有关，前向散射光信号与细胞大小有关，90°侧向散射光信号与细胞粒度有关。通过安装多个滤光片和不同波长的激光器就能得到更多的荧光信号和散射光信号，这对于人们认识细胞内化学物质的相互作用具有十分重要的现实意义。

　　1.4  分选系统

　　利用流动室喷嘴上的高频压电晶体的振动，将液流变成只包含单个靶细胞的小液滴，系统根据鞘流的流速与晶体振动的频率，精确算出小液滴的间距，然后对其施加相应的电压，当小液滴通过正负极板时就会发生偏转，流入相应的收集管里， 不带电的液滴就会流入中间的废液桶里，从而实现对细胞（ 包括中性粒细胞 ） 的分选 　　。

　　2  流式细胞仪的最新进展

　　2.1  光学系统的完善

　　随着激光技术的发展，激光器的性能更加优异，价格也更加低廉，这使得激光逐渐取代非相干光源，在流式细胞仪中得以广泛应用。目前，除德国的Partec 等公司的部分产品仍使用汞灯作为光源激发紫外的荧光物质外，多数的流式细胞仪都配备多个激光器，同时发出不同波长的激光以激发出多种荧光。例如BD 公司的 FACSAria 流式细胞分选仪除配备较为常用的488nm蓝光和640nm红光外，还配备 407nm 光源。同时，染料激光器的出现，使得光源发出连续可调的光谱成为可能，极大地扩展波长范围，可以满足用户多种特殊的需求。另外，通过配备多个光学滤光片，可同时检测多种荧光信号和包括 FSC 和 SSC 在内的信号，丰富人们的视野，更好地实现对细胞的检测。

　　2.2  灵敏度和分辨率的提高

　　灵敏度反映仪器能够检测到最弱的荧光和散射光信号，直接决定能否检测出待检测指标。灵敏度主要与待检测物体被激光照射效率和荧光接收效率有关，灵敏度的高低也是衡量流式细胞仪性能的最重要指标之一 ［4］。通过使用更加贴近最大吸收波长的激发光源和改善光路系统设计能够有效提高流式细胞仪灵敏度，同时，使用较高灵敏度的光电检测元件也可以分析微弱的荧光信号，较大程度上提高流式细胞仪灵敏度。目前流式细胞仪多使用石英微流动室 和数值孔径较大的物镜，使得收集到的细胞荧光信号显著增强。另外，通过使用光子计数系统，也能够实现对一些微弱荧光信号的检测。光子计数系统具有较高灵敏度，但是检测面积比较小，使用时应该用高质量的透镜组将光子汇聚到它的有效面积上。随着荧光技术的发展，市场上出现更多类型的荧光染料可供选择，荧光的激发光强也有很大的提高， 实现灵敏度提高。另外， 使用高透射率、高折射率的光纤，也能够更好地与光源、光电检测器和芯片耦合，显著降低光强损失，提高仪器灵敏度。