可编辑碱基对长度从几十扩至数千，「先导编辑」系统让治疗复杂遗传病成为可能？业内人士：递送挑战仍存，长期安全性有待观察

在刚刚结束的 2021 年，基因编辑领域交出了令人较为欣喜的成绩单。

6 月，诺奖得主 Jennifer Doudna 创办的公司 Intellia 和再生元共同发布一项 CRISPR 候选****物临床 I 期试验中期数据，结果表明该****物实现了对患者肝脏内细胞的基因编辑，且安全性良好。这一试验结果以题为“CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis”的文章发表在国际顶尖医学期刊 The New England Journal of Medicine (NEJM) 上，为全球范围内首个公开报告的体内 CRISPR 基因编辑疗法临床试验结果，并被 Science 纳入当年 “年度十大科学突破”。

12 月，基因编辑领域知名科学家刘如谦（David R. Liu）团队在 Nature Biotechnology 上发表论文表示，其对基因编辑系统 “先导编辑”（Prime Editor，以下简称 PE）进行了更新，新版本的 PE（PE3.0）在人类细胞中可编辑的基因长度扩展至数千对碱基（长度相当于一条完整的基因），而上一版本系统中这一数字为数十。这一突破被认为是基因编辑治疗向更安全、更精准迈出的重要一步。

“实现大片段碱基对的修复，有助于扩宽基因编辑技术治疗疾病的范围。” 瑞典卡罗琳斯卡医学院副教授郑宗立对生辉如此表示。

其实，回顾 20 世纪末至今，基因编辑领域共出现三大主流技术，从 ZFN、TALENs，再到如今被广泛使用的 CRISPR/Cas 系统，基因编辑效率不断提高，应用范围逐渐扩大，为基因功能研究提供有力工具的同时，也让传统手段无法医治的复杂疾病看到可被治疗的希望。

从工作机制上看，ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 都是在基因组靶标位点引起 DNA 双链断裂，进而激活细胞自我修复机制，完成基因的编辑。只是，与 ZFN 和 TALEN 技术需靶向 DNA 序列中特异性蛋白诱发 DNA 双链的断裂不同，CRISPR/Cas 系统则避免了这一繁琐的步骤，通过利用一段特定序列的向导 RNA 分子（guide RNA，gRNA）将核酸内切酶引至靶点，更高效地完成基因编辑，这也是 CRISPR/Cas 技术得以广泛应用的原因。

这三种基因编辑方法下，可有效改变基因的表达，但缺少对基因编辑结果的掌控：DNA 双链断裂后的自我修复过程中，较易引起随机插入、缺失的异源末端连接以及需要同源模板才可激活同源重组修复的情况，存在一定的不确定性。

面对这一问题，科学家在不断探索新的方案。2016 年，David Liu 团队在 Nature 发表论文表示，他们开发了 CRISPR-Cas9 单碱基编辑器，可在不导致 DNA 双链断裂的情况下实现对基因组点突变的定向修改；2019 年，David Liu 团队公布其基于 CRISPR-Cas9 开发的无需 DNA 双链断裂的基因编辑系统 ——Prime Editor（“先导编辑” 系统），相关论文发表在 Nature 上。

可以说，CRISPR/Cas 打开了高效基因编辑的新局面，而在此基础上实现的 Prime Editor 实现了更精准的基因编辑。

如上述提到的 David Liu 团队 2019 年所发文章标题所示，Prime Editor 是一款遵循 “查找 - 替换”（search-and-replace）逻辑运行的基因编辑系统。

为实现如文字编辑器中方便快捷的 “查找 - 替换” 工具效果，他们率先对 CRISPR-Cas9 系统两大组成部分 ——Cas9 酶和 gRNA 进行了 “替换”：一方面将向导 RNA 分子进行改造，在其 3' 端添加一段 RNA 序列，即引物结合序列（Primer binding site，PBS）和转录模版序列（RT template），形成能够结合特定目标基因且自带基因编辑模板的 RNA 分子，被称作基于改造的向导 RNA（the engineered guide RNA ，the pegRNA）；另一方面，用 Cas9 切口酶（Cas9 nickase）和逆转录酶融合而成的蛋白复合体替换 Cas9 酶

该 PE 系统之下，Cas9 切口酶可在 pegRNA 指引下定位到目标位置，对 DNA 单链进行切割。之后 pegRNA 3′端的引物结合序列与切断前的互补序列识别配对，逆转录酶以 pegRNA 上与引物结合序列形成后的序列为模板进行逆转录，将目标序列聚合至切断的 DNA 链上。接下来，细胞将通过自身的 DNA 修复机制把新的 DNA 序列整合到基因组。

这样，在 pegRNA 的 “限制” 下，该系统可有效减少脱靶效应，在切断 DNA 单链的情况下，实现对碱基的精准转换、插入和缺失等，最多可插入 44bp，或删除 80bp，若超过 100bp 的 DNA 片段，系统编辑效率将会降低。这一研究论文中提到，理论上，PE 系统可对人类 89% 遗传疾病相关的基因变异进行纠正。

但应用于实际研究或治疗人类遗传疾病，需要编辑的 DNA 片段要更长。为扩大基因编辑技术研究和治疗疾病的范围，在那之后，David Liu 团队对 PE 系统进行了两次升级。

他们发现，PE 系统中使用的 pegRNA3' 端降解导致系统活性降低，为基因编辑效率较低的一大原因。对此，David Liu 团队开发了工程化的 pegRNA，将 PE 系统基因编辑效率提升 3-4 倍。这一研究进展于 2021 年 10 月发表在 Nature Biotechnology 上。

12 月，David Liu 团队 PE 系统的升级版 “twinPE” 在 Nature Biotechnology 上发布，使用 twinPE 系统，可插入、替换或删除的序列长度约为 800bp。在 twinPE 系统中，David Liu 团队将 pegRNA 增加至两条，进行基因编辑过程中，这两条 pegRNA 将在特定位置分别对 DNA 链进行切割。同样是 DNA 双链断裂，不同的是，twinPE 选择在不同位置对 DNA 双链进行切割，确保 DNA 双链不完全断裂，实现基因编辑结果的可控性。

此次研究中，他们在人体细胞中对引起罕见遗传病亨特综合征（Hunter syndrome）的相关基因进行了编辑，该疾病由长度为 4000bp 的 DNA 片段导位引起。研究人员使用 twinPE 将数千碱基对大小的 DNA 片段精确插入到基因组的异常位点。

这表明，twinPE 系统具备应用于大型基因突变所致遗传疾病治疗的潜力。

然而，对于基因治疗领域绕不开的递送问题，PE 系统自然也不例外。而且，“ Priem Editor 带有的逆转录酶比较大，更增加了递送难度。”

除此之外，“基因治疗面临的挑战还包括精确的编辑（PE仍可产生Indel副产物）、未知的人体系统免疫反应以及脱靶等长期安全性问题”。郑宗立说道，该系统引入的逆转录酶对于人体属于“外来物”，它是否会对细胞及人体产生潜在的影响，还需要长期的观察。
过去两年，全球体内基因编辑疗法开始进入临床，首例人体试验数据也在去年公布。而对于基因编辑技术更大规模地应用于临床，郑宗立表示，长期安全性、有效性问题仍是最大的挑战。
参考资料：

• https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4
• https://www.science.org/content/article/breakthrough-2021#section_breakthrough
• https://www.nature.com/articles/s41587-021-01133-w
• https://www.broadinstitute.org/news/new-prime-editing-system-inserts-entire-genes-human-cells
• https://www.broadinstitute.org/news/new-crispr-genome-editing-system-offers-wide-range-versatility-human-cells
• https://mp.weixin.qq.com/s/9A6Vsxgz0IXaJ7e3L68Cmw
• https://baike.baidu.com/tashuo/browse/content?id=a800080106745dd97170f31f