复旦校友揭开二十年来“不明”机理，获得稳定的DNA损伤反应与修复核心激酶抑制剂，为相关抗癌****设计指明方向

他本科就读于复旦大学，期间参加复旦和伯明翰大学的“2+2”联合培养，获一等荣誉学位毕业后，赴剑桥大学攻读博士学位，师从生物化学系教授汤姆·布伦德尔爵士（Sir Tom Blundell）。博士毕业以来，一直在该课题组留任博后。
布伦德尔爵士是全球结构生物学、蛋白晶体学的先驱之一，亦是最早运用蛋白结构和生物信息分析来指导小分子****物开发设计和优化的结构生物学家。他于 1984 年当选英国皇家学会会员，1996 年到 2009 年担任剑桥大学生物化学系主任，曾任英国科学委员会主席。

2022 年 1 月 5 日，由梁世康和布伦德尔担任共同通讯作者的论文，以题为《DNA修复蛋白 DNA-PKcs 抑制剂调控的结构见解》（Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs）发表在 Nature[1]。
梁世康指出，过去二十年以来学术界和制****界一直未能很清楚了解的小分子抑制剂和人体 DNA 损伤修复核心蛋白激酶（DNA-PKcs）的作用机理。
论文揭示了相关机理分子水平的细节，这为相关抗癌****物的设计提供了明确方向指导，也揭示了配体结合对于 DNA-PKcs 后续催化反应的促进效果，同时在基于结构的****物开发和设计上再次展现出冷冻电镜的重要潜力。

DNA 依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）在非同源端连接中起着重要作用，这是人类检测和修复 DNA 双链断裂（DSBs）的两种主要途径之一。

DNA-PKcs 在修复病理性 DSBs 中具有重要作用，结合 DSBs 诱导的放疗和化疗，DNA-PKcs 抑制剂已成为很有吸引力的癌症治疗****物。目前，已开发的许多 DNA-PKcs 选择性抑制剂在治疗各种癌症方面具有潜力。

该研究报道了从 HeLa 细胞核提取物中纯化的天然人类 DNA-PKcs 与不同配体复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构。这些配体包括腺苷-5'-（-硫代）-三磷酸盐（ATPγS）和四种抑制剂（渥曼青霉素、NU7441、AZD7648 和 M3814），其中包括正在进行临床 I、II 试验的候选****物。

而该结构揭示了配体在 ATP 位点结合的分子细节，并提供了对竞争抑制剂的作用模式和特性的见解。值得注意的是，配体的结合导致 PIKK 调控域（PRD）发生移动，揭示了 p 环和 PRD 构象之间的连接。

电泳迁移率测定和 cryo-EM 对 DNA 依赖蛋白激酶全酶的研究进一步表明，配体结合对全酶复合物的组装没有负面的变构或抑制作用，抑制剂通过与 ATP 直接竞争发挥作用。

作为细胞信号传导的主要调控者， 蛋白激酶的相关制****在各个疾病领域尤其是癌症上，展现出惊人疗效和巨大潜力。

DNA-PKcs 作为人体 DNA 损伤反应与修复的核心激酶，更是延缓和治疗癌症的重要靶点。抑制 DNA-PKcs 活性可以阻断相关 DNA 修复通路，加速紊乱癌细胞的基因组来杀死癌细胞。

此外，对于通过破坏癌细胞基因组稳定来杀死癌细胞的治疗方式、比如放疗和化疗来说，抑制 DNA-PKcs 活性还能加强治疗效果。

因此，学术界和制****界一直在针对 DNA-PKcs 的抑制剂进行研发。尤其是制****公司通过高通量筛选和****物分子优化设计，开发出了第一代和第二代特异性抑制剂，并已有数个小分子****物进入临床 I、II 期试验。

然而，因为蛋白自身大小、灵活度、稳定性和取向偏好等因素，在晶体时代和自冷冻电镜革命以来，其相关结构研究进展缓慢，一直无法获得蛋白和抑制剂相互作用的高分辨率结构信息。

基于该问题，梁世康运用冷冻电镜，在添加自制单层氧化石墨烯薄膜作为基底和优化实验条件之后，获得了稳定的 DNA-PKcs/抑制剂复合物，并解析出了相关高解析度结构。

通过天然配体/广谱抑制剂/第一、二代特异性抑制剂，与 DNA-PKcs 相互作用机理的纵向比较，结合其同源激酶家族成员、与配体和抑制剂相互作用机理的横向比较，他们首次得以从分子层面阐释 DNA-PKcs 抑制剂特异性差异的原因，并为新一代抑制剂的设计和优化提供了指导思路。


不仅如此，各种配体在同一结合位点的不同作用方式，也揭示出 DNA-PKcs 催化中心内部不同结构域之间的协同运动，展现出配体对底物结合的促进作用，这也帮助梁世康进一步了解相关催化机理。

总的来说，该研究中描述的结构将极大地帮助未来靶向 DNA-PKcs 的合理****物设计，展示 cryo-EM 在结构引导的大型和挑战性目标****物开发中的潜力。

选择和努力一样重要，这同样适用于科研圈。正因为梁世康选择了布伦德尔，布伦德尔选择了他，才有了今天的成果。

多年以来，布伦德尔教授持续关注研究人体 DNA 双链断裂修复的相关结构机理。2001 年，该实验室开始 DNA-PKcs 相关的结构研究，2009 年率先得到 DNA-PKcs 的晶体，并解析出 6.6Å 的蛋白结构 [2]。

2017 年，在优化结晶条件和使用硒代蛋氨酸标记的基础上，该团队成功解析出 4.3Å 的晶体结构，成功提出第一个 DNA-PKcs 的原子结构模型[3]。

梁世康回忆称，刚进实验室读博时，他的课题是运用晶体衍射的方法，来研究包括蛋白-蛋白和蛋白-配体在内的、与 DNA-PKcs 相关的蛋白复合物。

但是由于相关蛋白表达难、无序度高、稳定性低、提纯复杂以及产量低，结晶难等一系列挑战因素，让其早期研究进展非常缓慢。

他说：“有时做了整整一周的蛋白纯化，却只能拿到几百微克的蛋白样品，只够测试和优化很少的实验条件。”

在不停做实验的同时，他也不断地跟导师、实验室前辈和同事探讨，并通过阅读文献不断“充电”。在导师的信任和支持下，他积极拓展研究方法，开始运用冷冻电镜单颗粒技术。

其表示：“让我很难忘的，是解出 DNA-PKcs/NU7441 复合物结构也是第一个 DNA-PKcs / 配体复合物结构的那天晚上。”
不同于多蛋白组分复合物可在电镜下、或二维投影里直接看出结合伴侣是否存在，因为配体是小分子，在得到三维结构之前，很难判断其是否作用在结合位点上。

由于之前不少尝试都不尽如人意，在计算机上分析这套数据时，梁世康已经开始思考接下来可行的优化实验和具体安排。

而在得到三维结构之后，当他在结合位点里清楚看到来自配体的信号的那一刻，他十分欣喜，这意味着能以此为基础，来研究其他特异性不同的抑制剂和 DNA-PKcs 的相互作用。

对于该研究的应用价值，他说：“最直接、最明显快速的应用前景，在于可指导新一代针对 DNA-PKcs 的小分子激酶抑制剂的设计。”

在获悉抑制剂和蛋白的作用机理，也通过一系列横向与纵向对比，弄清楚抑制剂特异性的来源之后，即可结合生物信息分析****物靶点的结构特性，去设计特异性更好、与结合位点更适配的小分子抑制剂。

说到这里他表示：“我们发表并公开了所有相关结构，这样不仅是我们课题组，全世界其他研究小组和制****公司都可使用此次发布的结构信息，来优化和指导已有小分子****物。虽然离让广大病患使用到具体****物还有很长一段路，但这无疑可以加速相关抗癌****物的研发，助力未来造福患者。”

不仅如此，该研究也是一个很好的概念验证，对于 DNA-PKcs 这种颇具挑战性的蛋白来说，证明了运用冷冻电镜来做基于结构的****物设计是可行的。

除传统小分子激酶抑制剂和****物靶点之外，借助该研究也可关注其他类型****物 ，比如蛋白降解靶向嵌合体、以及多肽和其他结合位点。
相比目前已成熟的传统激酶抑制剂研究，尽管这些发展和应用更加耗时耗力，成本也相对高昂，但是****物发展充满各种可能性，值得积极尝试。

接下来，梁世康也会牵手合作团队，探究新一代抑制剂的优化，以追求更好的特异性和结合强度，并将继续深耕人体 DNA 损伤反应与修复以及相关新型****物分子的开发。

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参考：
1、Liang, S. et al. Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs. Nature (2022) DOI: 10.1038/s41586-021-04274-9
2、Sibanda, B. L., Chirgadze, D. Y., & Blundell, T. L. Crystal structure of DNA-PKcs reveals a large open-ring cradle comprised of HEAT repeats." Nature 463.7277 (2010): 118-121.
3、Sibanda, B. L., Chirgadze, D. Y., Ascher, D. B., & Blundell, T. L. DNA-PKcs structure suggests an allosteric mechanism modulating DNA double-strand break repair. Science（2017）：355(6324), 520-524.