诺奖得主Ardem Patapoutian丨Piezo1的发现用了一年，开发更高通量系统，寻找更多机械敏感蛋白

Patapoutian 发现的 Piezo1 和 Piezo2 离子通道在触觉、运动感知、血压、呼吸和膀胱控制等生理过程中起重要作用。
而除了离子通道之外，Patapoutian 还发现了另一类压力传感器， G 蛋白偶联受体 (GPCR) 中一种叫做 GPR68 的蛋白，在小直径（阻力）动脉的内皮细胞中表达，可作为剪切应力传感器，是心血管病理生理学中的关键信号组件。
这篇题为 “GPR68 senses flow and is essential for vascular physiology” 的文章于 2019 年发表在 Cell 上。高通量筛选出 GPR68 基因

在发现 Piezo1 的实验中，该团队进行了功能基因组小干扰 RNA (siRNA) 筛选，使用薄膜压痕和电生理记录，这是一个低通量筛选，该团队用了近一年时间，在筛选了 72 个候选基因后，才最终确定了 Piezo1 基因。
为了加速与机械转导相关的基因组筛选，团队重新设计了一种新型的 384 孔高通量 (HT) 机械刺激系统，并使用已经发现的 Piezo1 基因验证了该系统的准确性和可行性。

研究人员通过初筛，选择了对剪切力变化最敏感的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 进行实验，将该细胞的 Piezo1 和 Piezo2 基因敲低，发现并不影响细胞的剪切应力响应，说明该细胞还存在其它分子负责传感剪应力。
于是研究人员针对编码具有两个或多个预测跨膜结构域的蛋白质基因构建了 siRNA 文库，该文库包含 21,925 个独特的 siRNA，靶向由 2,765 个独特基因编码的 3,175 个独特参考序列。

最终研究人员确定了 GPR68 基因，该基因敲低会导致细胞对剪切应力响应程度下降。GPR68 被描述为质子激活的 GPCR，实验结果也表明 MDA-MB-231 细胞在 pH 值 7.4-6.9 时（正常动脉血 pH 值约为 7.4，6.9 代表严重酸中毒）对剪切应力响应最敏感，表明 GPR68 确实需要质子的存在才能感知剪切应力。
研究还发现，GPR68 与其他已知的机械敏感性 GPCR 不同，在同等条件刺激下，仅有 GPR68 能产生响应，其它受体均无任何反应，说明了 GPR68 对剪切应力的独特敏感性。

在模拟血液层流测试中，GPR68 也能够对压力刺激产生响应，而其它与层流传感器有关的蛋白质则无响应。GPR68 的血管生理作用

研究确定了 Gpr68 优先在小直径阻力动脉中表达，小直径阻力动脉是调节血流阻力的主要部位，表明 Gpr68 可能在血流介导的血管舒张中发挥作用。
为了测试这一点，研人员从纯合 Gpr68-eGFP 小鼠的大脑中分离出小鼠原代微血管内皮细胞 (MVEC)，并测定它们对流动室中剪切应力的反应。随着压强逐渐增加，表达 Gpr68 的内皮细胞通过增加细胞内钙水平对流动作出反应，降低其基因表达水平后，反应消失。这些结果表明 MVEC 细胞中的内源性 Gpr68 是剪切应力响应所必需的。

然后研究人员从 Gpr68 基因敲除鼠中分离了肠系膜动脉 (MA) 并进行了体外插管实验，使用去氧肾上腺素刺激血管收缩，发现其 3 阶（研究将肠系膜动脉由主支到分支，由粗到细分为 1、2、3 阶）血管的收缩程度显著低于正常小鼠，1、2 阶血管没有明显差别。
研究人员继续使用了一种名为 Ogerin 的 GPR68 变构调节剂（可以特异性调节人和小鼠 GPR68 的活性）刺激血管，如预想一样，Ogerin 可以刺激正常小鼠 3 阶血管的剂量依赖性扩张，但 Gpr68 基因敲除鼠的血管在 1 nM 到 1 μM 的 Ogerin 浓度范围内没有扩张反应。
上述结果说明，Gpr68 基因是体外小鼠小直径肠系膜动脉的流动介导的扩张反应所必需的。
研究人员还证明了在血管缺血情况下，GPR68 可促进旁支血管直径增大，介导血流量增加引起的血管外向重塑 ，同样这一作用也只限定于小直径动脉。
综上所述，研究人员证明了 GPR68 是小动脉内皮中必不可少的流量传感器。
文章最后指出，高通量剪切应力刺激系统极大地提高了机械转导分析的通量，这种使能技术使得对新型机械敏感蛋白和通路进行无偏见的全基因组筛选成为可能。新型机械传感器 GPR68 的鉴定验证了这一创新系统的价值和潜力，并扩展了在体内感知机械力的膜蛋白库。

参考资料：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5951615/
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