离心技术的应用

　　由于ρ_P＞ρ_m可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

　　（三）等密度离心法

　　等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρ_m＞ρ_P时粒子上浮；在弯顶处ρ_P＞ρ_m时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρ_P＝ρ_m，此时dx/dt为零粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

　　此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。

　　（四）梯度溶液的制备

　　⒈梯度材料的选择原则作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。②可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。③不会对离心设备发生腐蚀作用。④容易纯化，价格便宜或容易回收。⑤浓度便于测定，如具有折光率。⑥对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶胶：如Percoll。⑤蛋白质：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有机物：如氟代碳等。

　　⒉梯度材料的应用范围

　　⑴蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。

　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

　　⑶氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。

　　⑷卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

　　⑸Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。

　　三、分析性超速离心

　　与制备性超速离心不同的是：分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续监视物质在一个离心场中的沉降过程。

　　（一）分析性超速离心的工作原理

　　分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳二个小室：分析室和配衡室。配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分析室的平衡用。分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普遍水平转子相同。分析室有上下二个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折谢率的不同对沉降物进行监视。后一方法的原理是：当光线通过一个具有不同密度区的透明液，在这些区带的界面上产生光的折射。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一“峰”。由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。图16-5是分析性超速离心系统的示意图。

　　（二）分析性超速离心的应用

　　⒈测定生物大分子的相对分子重量测定相对分子重量主要有三种方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中应用最广的是沉降速度，超速离心在高速中进行，这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标，然后用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。

　　分子或粒子的相对分子重量则可从Svedberg方程式来确定：

图16-5　分析性超速离心系统图示

　　式中M：该分子不含水的相对分子重量；R：气体常数；T：绝对温度；S：分子的沉降系数；ν：分子的微分比容（当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积）；ρ：溶剂的密度。

　　⒉生物大分子的纯度估计静分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。

　　⒊分析生物大分子中的构象变化分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化，例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的，如果遇到某种因素（温度或有机溶剂）DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆，这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。